峰前延、展宽、分叉！隐形杀手——溶剂效应，到底如何有效解决？……

色谱峰形隐形杀手——溶剂效应

关于溶剂效应，小编今天想和各位老师从专业&技术角度更深入探讨一下溶剂效应。我们在液相或液质分析过程中，会经常遇到峰前延、色谱峰展宽，分叉等。例如下面这样的峰：

我们往往容易把以上异常的峰形误判为色谱柱损坏、或填料塌陷、或仪器问题等，逐一排查系统、色谱柱等都正常，可为何会出现如此奇怪的峰形，百思不得其解。蓦然回首，原来问题就出现在溶剂效应，这个隐形的杀手上。

溶剂效应为何物？

通常情况下对于溶剂效应的理解为稀释剂溶剂强度大于流动相时造成色谱峰变形的现象。

举个形象的例子，便于大家理解：

如用100%乙腈溶解样品，注入到流动相为乙腈-水（18:82）的反相系统中，会造成峰分叉结果见图A。而采用流动相溶解样品，在注入到流动相中，峰形恢复成正常，见右图。

用通俗的话来描述，溶剂效应的产生是由于样品溶剂与流动相不匹配引起的

样品溶剂与流动相的“不匹配”包括：

●   二者的洗脱能力差异；

●   二者的互溶能力差异；

●   样品分子在二者中的溶解性差异；

●   样品分子在二者中分子态和离子态的分布差异；

溶剂效应产生的机理？

也许大家会纳闷，为何样品溶剂与流动相不匹配就会产生溶剂效应了？

下面带着大家从进样过程进行深度剖析

色谱分析，进样过程可分为三个阶段，第一个阶段是样品到达色谱柱，第二阶段是样品部分进入色谱柱，第三个阶段是样品全部进入色谱柱。

而溶剂效应主要产生于进样过程的第二个阶段，即样品部分进入色谱柱。

我们对溶剂效应产生的第二个解读详细分析其过程，第二个阶段又可分为3个进程，以下对3个进程进行详细讲解，让大家可以了解溶剂效应产生的前世今生。

第二阶段产生溶剂效应剖析

进程1

样品溶液(X先+A先)与柱内流动相B进行混合，样品分子X先从样品溶剂A先中被释放出来，进入流动相B中；

先进入色谱柱的样品X先在样品溶剂A分子的包围中，而C18长链则为流动相B所包裹，样品X先的保留行为是否能顺利进行，首先取决于它能否顺利的进入流动相B中，只有进入了流动相B中才能接触到C18长链并有所保留。所以要挑选与流动相互溶性好的试剂来做样品溶剂。

在此进程中，样品溶剂A先被稀释，样品X先周围的环境由“样品溶剂A”变成了样品溶剂A与流动相B的“混合液A+B”并快速进一步转变为“流动相B”。

在进程1中可能产生溶剂效应的情况：

反相体系中用正己烷、氯仿、二氯甲烷等与水或其它流动相互溶性不太好的溶剂来溶解样品时，出现峰形异常，可能与进程1不顺畅有关。

进程2

进入流动相B中的样品X先与C18长链接触，发生分子间作用力，二者间的作用力是样品分子产生色谱保留行为的必要条件；

在进程2中可能产生溶剂效应的情况：

流动相中含离子对试剂而样品溶剂中不含时，由于样品分子在样品溶液中呈离子态，样品是否有保留以及保留时间的长短，与样品分子能否与离子对试剂结成不带电的配对化合物有关，只有 “结成不带电的配对化合物”才能与同为不带电的C18长链发生较强的分子间作用力，产生保留，而未能配对的离子态化合物则与C18的作用力相对较小，样品的保留时间会来回波动，稳定性差。

这种保留时间不稳定的现象，可能是因为样品在进程2同时存在分子态和离子态引起的，两种状态与C18长链的作用力不同，引起了浓度分布的变化。

进程3

先进入色谱柱的样品X先在样品溶剂A后的推动下开始洗脱，此时样品溶剂A扮演着双重角色——溶解样品+ 瞬时流动相。

1、以定量环10ul，系统管路内径ID=0.25mm来计。进样10ul，进入系统管路时将充满204mm的管路(10÷(0.125x0.125x3.14)=204），本进程是样品部分进入色谱柱，假设有一半样品即5ul先进入色谱柱，另一半（即如图的样品X后+样品溶剂A后）则存在于一段102mm长 的管路上，这段溶液（样品X后的含量可以忽略不计，主要为样品 溶剂A后）承担着样品X先流动相的角色。

2、由于样品溶剂A后的量非常少，只有几微升，因此它作为流动相的时间非常短，5ul的体积按1.0ml/min流速计，作用时间只有0.3s，因而称它为瞬时流动相。

3、虽然此时样品溶剂A后作为流动相的时间非常短暂，是瞬时流动相，但是由于此时样品的浓度非常大，细微的扰动都会引起色谱柱内浓度分布的巨大变化，因此它带来的影响是巨大的。样品溶剂A的瞬时流动相角色带来的影响——浓度分布不对称，峰形异常。

4、这里“样品溶剂A”的瞬时流动相作用，实际上更确切的来说应该是指图中 “样品溶剂A后”的瞬时流动相的作用。

5、回到 “溶剂效应产生的根源”，“样品溶剂与流动相洗脱能力差异较大”这种不匹配是引起溶剂效应最常见的一种原因，在此我们以这种因素为例进行分析。

6、以样品溶剂A为100%甲醇、流动相B为甲醇:水=20:80为例，组成上二者的甲醇含量比例相差80%，洗脱能力差异很大，100%甲 醇>>20%甲醇。

7、由图1可知，先进入色谱柱的部分即样品X先的流动相为样品溶剂A后=100%   甲醇，而样品X后的流动相则为流动相B=20%甲醇，由于洗脱能力的差异：100%甲醇>>20%甲醇，因此样品X先在本进程中前移的速度比样品X后快，由此引起样品浓度分布中心前移，变成了前延峰，有时候甚至形成2个浓度中心，得到双峰。样品溶剂A的瞬时流动相角色带来的影响——浓度分布不对称，峰形异常。

8、样品溶剂A后（组成为100%甲醇）的瞬时流动相角色使样品X先前移的速度比样品X后快，导致了浓度分布的部分前移（样品溶剂A后的量很小，只有几微升，只能使一部分样品前移，见下图2），谱图上得 到一个前延峰。

解决溶剂效应的方法和措施？

剖析：用流动相或初始流动相溶解样品，是通过将洗脱能力强的“样品溶剂A”换成弱的“流动相B”， 使X先和X后的流动相相同，前移速度一致，因而获得对称的峰形，消除溶剂效应。

应用图谱

优点：

用流动相(等度)或用初始流动相(梯度)溶解样品，往往能获得最佳的峰形、柱效和分离度，是消除溶剂效应最理想的方案。

缺点：

1. 药典或国标等权威部门制定的方法不能随意改变，更换样品溶剂通常认为是对方法的改变，一般不被允许， 如要改变，须得通过一系列复杂的方法学验证之后才可以。

   
   

2. 中药、中成药、指纹图谱等的分析，成分复杂，峰太多，需要走梯度才能分开，初始流动相通常有机 相比例都很低，而样品的前处理往往有机溶剂比例较高，容易出现溶剂效应，如果样品用初始流动相溶 解则需要耗时耗力的吹干复溶过程，成本太高。

   
   

3. 食品和农残的分析，由于含量低，通常需用固相萃取浓缩或溶剂置换，最后的淋洗液一般是甲醇或乙腈，洗脱能力强，直接进样容易产生溶剂效应，要转用流动相溶解则需进行吹干复溶，费时费力，成本太高。

   
   

4. 用流动相(等度)或用初始流动相(梯度)溶解样品，有时候难以实现，如：1）质保期的原因，通常大部分样品在甲醇或乙腈等纯有机溶剂中更稳定，标准溶液质保期长，省事；   2）稳定性的原因，一些样品在流动相中不稳定，无法选择用流动相溶解样品；

   
   

5. 溶解性的原因，一些样品在流动相中溶解性太差，无法选择用流动相溶解样品；

当洗脱能力样品溶剂A >> 流动相B时，由于样品溶剂A瞬时流动相的作用，X先前移的速度比X后快，容易产生峰形前延。峰形前延的程度与进样量有关，进样量越大，样品溶剂A后的量也越大，将X先往前推的动力就越大，因此前延越厉害，溶剂效应越明显。反之进样量越小，溶剂效应也越小。因此减小进样量能有效削弱或消除溶剂效应。

谱图：

随着进样量的减小，溶剂效应也越来越小

优点：

通过减小进样量消除溶剂效应，优点是简单、快速，不需要改变任何其它条件，可预测性强。

缺点：

1. 优良峰形的获得是以牺牲灵敏度为代价，进样量的减小会使检测灵敏度下降，在目标化合物含量本就较低的情况下（ 如农残和环境样品的检测），此方案不可取。

   
   

2. 灵敏度和检测限是评价一个方法好与不好的重要指标，在万不得已的情况下通常尽量避免减小进样量。

专利设计：空腔结构——容纳流动相，拉平样品溶剂与流动相的差异（材质：316L不锈钢+Peek材质，耐腐蚀、长寿命）

原理概括：它优化了进样过程第2阶段的“进程1”和“进程3”

1、热身——让样品分子提前进入预分离状态

进样过程是要把样品分子带到C18长链身边并相互接触，由此才能顺利的发生色谱保留行为，但 二者所处的氛围是不同的，样品分子存在于样品溶剂氛围中，而C18长链则存在被流动相所包围， 要使二者能够顺利的接触，需让样品溶剂与流动相更快的相互融合，这是在前述“进程1”中发生的 事情。溶剂效应消除器的作用是，在样品分子接触填料前就已将“融合”这一步挪到其空腔中提前完成，使样品分子从样品溶剂氛围进入流动相的氛围更平滑顺畅，促进了样品分子与C18长链接触并发生作用的过程，为正式的色谱分离做了热身运动。

2. 拉平效应——拉平了样品溶剂A与流动相B之间的洗脱能力差异。

在“进程3”中，先进入色谱柱的样品X先与后进入色谱柱的样品X后二者的流动相不同，样品X后 的流动相始终是“流动相B”不变，而样品X先的流动相则是在进样过程中这一特殊时刻样品溶剂A后 所扮演的“瞬时流动相”，因此样品溶剂A与流动相B之间洗脱能力的大小直接影响到样品X先与样品 X后移动速度的快慢，进而引起色谱柱内样品浓度分布的变化，造成溶剂效应。溶剂效应消除器的作用是，拉平、缩小了样品溶剂A与流动相B之间的洗脱能力差异，使样品X先与X后的移动速度趋于一 致，削弱、消除了溶剂效应，得到尖锐而对称的峰形。

优点：

1. 对现有方法：无需改变任何其它条件，柱前加接后即可简单、快速的消除溶剂效应，获得更准确的分析结果 ；

2. 开发新方法1：样品溶剂的选择范围广，可用纯甲醇等有机相比例高的溶剂配制标准溶液或样品溶液，稳定性好，可长时间稳定保存，无需频繁配制。

3. 开发新方法2：因溶剂效应引起的峰形异常少，无需花费大量的时间用于选择样品溶剂的问题上，把主要精力聚焦于液相方法开发本身；

4. 开发新方法3：利用溶剂效应消除器的特点开发出省时省力的方法，确立为标准后，从源头上为后续执行标准的企业节省了大量的人力和物力成本，节约了社会资源。

缺点：

1、溶剂效应消除器的空腔体积有一定的限度，它能消除溶剂效应的容量是有限的，只有在一定的进样量范围内才能表现出好的效果。Solvs-AB 的推荐进样量为1-20ul，Solvs-UP的推荐进样量为1-10ul。

实际应用案例

某国家食品安全风险监测兽药残留参比实验室

——省去氮吹，直接进样。提高了实验效率，降低实验成本

了解了溶剂效应产生的原理和机理，某国家食品安全风险监测兽药残留参比实验室老师，巧妙应用了溶剂效应消除器，对于GB 31656.8-2021水产品中有机磷农药残留测定，直接省去了氮吹过程（2-3小时），净化后，过滤膜直接进样，避免了氮吹浓缩过程带来的有机磷农药的降解和挥发，简便了操作过程，提高了回收率。

（注：GB 31656.8-2021中氮吹，其主要目的是为了溶剂置换）

关键效果还棒棒哒！

左:10uL进样（ 未加），右：10 uL（柱前增加溶剂效应消除器）

方法来源：客户

某农产品检测中心

——加大上样量，省去了添置高端仪器的大笔费用

某农产品检测中心客户，对于GB 23200.121-2021，375种多农残检测，由于液质设备灵敏度不高，小剂量进样无法满足设备检测要求，巧妙应用溶剂效应消除器，进样量可直接从 2ul 加大到 10ul，不但提高了灵敏度， 而且没出现溶剂效应。

客户万分感谢，没想到，小小一个配件，节省了他们单位一大笔固定资产购置成本。

（注：GB23200.121-2021之所以采用2ul小体积进样，主要是为了降低溶剂效应）

GB 23200.121 375种多农残LC/MS/MS检测

左：10ul 进样量 ( 未加） 右：10ul 进样量 ( 柱前加溶剂效应消除器）

方法来源：客户

某权威海关

——解决了强极性物质峰形问题

某海关客户。其仪器灵敏度的很高（AB 5500），溶剂效应问题，可以轻松通过减小进样量来解决，但在GB 23200.121-2021方法中，即使是小体积2 ul进样，对于一些强极性物质，比如甲胺磷，出峰时间早，极易受到溶剂效应的影响，导致峰分叉或出现两个峰。使用溶剂效应消除器后，较好解决了甲胺磷峰形问题，峰形更好，响应更高。

进样2µL其中的甲胺磷对比图

某大型制药企业

——显著改善峰形、提高柱效，杂质被检出

某大型制药企业，一直苦恼于溶剂效应问题，由于其样品溶解性问题，无法用流动相溶解，尝试了各种方法无法解决溶剂效应问题，造成峰前延、峰展宽、杂质被主成份峰遮住……没想到，使用溶剂效应消除器后，彻底解决了一直困扰他们多年的难题，显著改善峰形、提高柱效，杂质被检出。一下为实验室配备了20多套溶剂效应消除器，一个机器一个。

丹参制剂的分析

利培酮的有关物质分析

溶剂效应消除器简介

历时5年潜心打磨和研发的新产品，可有效解决样品溶剂与流动相匹配性不好而产生的各类色谱问题：

• 显著改善峰形、提高柱效

• 色谱基线更平稳、出峰时间更稳定

• 提高分离度和杂质检出能力

• 最大程度降低样品溶剂和流动相差异所产生的色谱分析问题

（谱宁发明专利，专利号: 201510005647.8）

两种型号：

常规的HPLC型，耐压40MPa，描述：Solvent-Smoother Solvs-AB，货号：AN80C036

超高压UPLC型，耐压70MPa，描述：Solvent-Smoother Solvs-UP，货号：AN80C037