下篇来啦!为什么别人做的回收率总比我高?新颁布36项兽残标准!发表时间:2022-06-30 13:10 2022年5月19日,纳鸥科技公众号发布了文章《为什么别人做的36项兽残回收率总比我高?(上篇)》:对GB 31656.8-2021、GB 31658.17、GB 31656.13三个常用标准的样品前处理关键点和要点等进行了总结,收到了广大检测工作者的积极反响。 现将后续3个标准:GB 31658.5(氟苯尼考及氟苯尼考胺残留量)、GB 31658.2(氯霉素残留量)、GB 31656.11(土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量)的前处理关键点和要点整理出来,供各位老师参考。 GB 31658.5-2021前处理关键点和要点 动物性食品中氟苯尼考及氟苯尼考胺残留量的测定 8.1 提取 取试料5 g(准确至±0.02g),加内标工作液250 µL、乙腈5 mL、 4 %氯化钠溶液5 mL,涡旋振荡2 min,4 000 r/min离心10 min,取上清液,残渣重复提取1 次,合并上清液。加正己烷5 mL,涡旋振荡1 min,2 000 r/min离心10 min,弃去上层液,正己烷重复处理1次。加水饱和的乙酸乙酯溶液5 mL,涡旋振荡1 min,2 000 r/min离心10 min,上层液转移到15 mL离心管中,重复提取1次,合并提取液,氮气吹干,加水-乙腈(95:5)3 mL使溶解,备用。 关键词:新国标与之前的国标GB/T20756-2006和GB/T22338-2008的区别 要点: Ø GB/T20756-2006是在碱性条件下用乙酸乙酯提取,后续是不用SPE进行净化。 Ø GB/T22338-2008这个方法比较复杂,针对不同的动物组织采用了不同的提取剂,然后后续用到SPE的净化,比如说鸡肉和内脏的组织是用硅胶小柱净化,相对比较复杂一些。 Ø GB 31658.2-2021是采用4%的氯化钠溶液和乙腈做提取剂。因为GB/T20756-2006是一个多残留方法,包括氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素,需要同时兼顾这三种药物残留的提取,碱性条件的提取,主要是为了让氟苯尼考、甲砜霉素有更加好的提取回收率。而GB 31658.2-2021是一个单残留的测定,只需考虑氯霉素残留的提取,所有无需碱性条件的提取。 关键词:动物组织中蛋白质、脂肪、杂质的去除 要点: Ø GB 31658.2是采用4%的氯化钠溶液对样品中的蛋白质进行沉淀,同时也加入了乙腈进一步沉淀样品组织中的蛋白质。然后,用正己烷进行萃取,去除动物组织中脂肪和杂质。接下来乙酸乙酯反萃取。 关键词:氮气吹干 要点: Ø 提取后,注意氮气要吹干,如果没有吹干,样品中含有乙酸乙酯对后面的进行小柱净化有影响。 关键词:加水饱和乙酸乙酯溶液反萃取 要点: Ø 由于洗脱液是用甲醇和水(1:1)4 mL,体积比较大,含水也比较高,不易挥发和浓缩。 Ø 加水饱和乙酸乙酯溶液进行反萃,实际上是进行了一个溶剂转换, Ø 转换的目的,一方面是乙酸乙酯溶液比较容易吹干,另一方面也增加了一次萃取和净化,使得样品更加干净,进一步去除杂质。 8.2 净化 取固相萃取柱,依次用甲醇、水各10 mL预洗。备用液过柱,加水洗柱2次,每次3 mL, 加流动相4 mL,以1 mL/min速度洗脱,收集洗脱液。加水饱和乙酸乙酯溶液4 mL,涡旋振 荡1 min,2000 r/min离心5分钟,取上层液,重复处理1次,合并上层溶液,氮气吹干。加流动相1.0 mL使溶解,滤过,供液相色谱-串联质谱测定。 关键词:预洗 要点: Ø 在净化过程中,C18小柱需要依次用甲醇、水各10 mL预洗,标准中净化柱使用的是传统的C18小柱 200 mg/6 mL (PN:AN60B004),是一个很早就商品化的小柱,净化之前,C18小柱需要提前预洗,不能直接对干的小柱进行活化,不然会影响到回收率。 Ø 这个与后续商品化的HLB-P小柱不同,HLB-P小柱省去传统的活化、平衡步骤,样品经提取后直接过柱。 关键词:多步骤的萃取和反萃取 要点: Ø 氯霉素提取和净化过程中经过了多步骤的萃取和反萃取, Ø 具体步骤:乙腈+4 %氯化钠溶液提取→正己烷脱脂→加水饱和乙酸乙酯反萃→水-乙腈(95:5)复溶解→流动相洗脱→水饱和乙酸乙酯→流动相溶解→上机。 Ø 在GB 31658.2这是一个很经典的提取体系,这么多次的萃取,实际上是利用了氯霉素在不同的溶剂体系中溶解度差异,从而来完成样液的净化和溶剂转换。整个过程包括了,萃取、反萃取、固相萃取柱净化,是一个很典型的样品净化和富集案例。 Ø 经过以上复杂的前处理操作流程,操作手法不太熟练,以及某些关键点没有注意到,很容易导致回收率受到影响。 GB 31658.2-2021前处理关键点和要点 动物性食品中氯霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 原理 试料中残留的氯霉素,采用间位氯霉素或氘代氯霉素作内标,依次用乙腈、4%氯化钠去蛋白,正己烷脱脂,乙酸乙酯提取,固相萃取柱净化,氮气吹干,液相色谱-串联质谱法测定,内标法定量。 8.1提取 取试料5 g(准确至±0.02 g),加内标工作液250 µL、乙腈5 mL、 4 %氯化钠溶液5 mL,涡旋振荡2 min,4 000 r/min离心10 min,取上清液,残渣重复提取1 次,合并上清液。加正己烷5 mL,涡旋振荡1 min,2 000 r/min离心10 min,弃去上层液,正己烷重复处理1次。加水饱和的乙酸乙酯溶液5 mL,涡旋振荡1 min,2 000 r/min离心10 min,上层液转移到15 mL离心管中,重复提取1次,合并提取液,氮气吹干,加水-乙腈(95:5)3 mL使溶解,备用。 关键词:动物组织中蛋白质、脂肪、杂质的去除 要点:
关键词:氮气吹干 要点:
关键词:加水饱和乙酸乙酯溶液反萃取 要点:
8.2净化 取固相萃取柱,依次用甲醇、水各10 mL预洗。备用液过柱,加水洗柱2次,每次3 mL, 加流动相4 mL,以1 mL/min速度洗脱,收集洗脱液。加水饱和乙酸乙酯溶液4 mL,涡旋振 荡1 min,2000 r/min离心5分钟,取上层液,重复处理1次,合并上层溶液,氮气吹干。加流动相1.0 mL使溶解,滤过,供液相色谱-串联质谱测定。 关键词:预洗 要点:
关键词:多步骤的萃取和反萃取 要点:
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