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下篇来啦!为什么别人做的回收率总比我高?新颁布36项兽残标准!

发表时间:2022-06-30 13:10

2022年5月19日,纳鸥科技公众号发布了文章为什么别人做的36项兽残回收率总比我高?(上篇)》:对GB 31656.8-2021、GB 31658.17、GB 31656.13三个常用标准的样品前处理关键点和要点等进行了总结,收到了广大检测工作者的积极反响。


现将后续3个标准:GB 31658.5(氟苯尼考及氟苯尼考胺残留量)、GB 31658.2(氯霉素残留量)、GB 31656.11(土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量)的前处理关键点和要点整理出来,供各位老师参考。




GB 31658.5-2021前处理关键点和要点

动物性食品中氟苯尼考及氟苯尼考胺残留量的测定


8.1 提取试料5 g(准确至±0.02g),加内标工作液250 µL、乙腈5 mL4 %氯化钠溶液5 mL,涡旋振荡2 min4 000 r/min离心10 min,取上清液,残渣重复提取1 次,合并上清液。加正己烷5 mL,涡旋振荡1 min2 000 r/min离心10 min,弃去上层液,正己烷重复处理1次。加水饱和的乙酸乙酯溶液5 mL,涡旋振荡1 min2 000 r/min离心10 min,上层液转移到15 mL离心管中,重复提取1次,合并提取液,氮气吹干,加水-乙腈(95:53 mL使溶解,备用。


关键词:新国标与之前的国标GB/T20756-2006GB/T22338-2008的区别

要点:

Ø   GB/T20756-2006是在碱性条件下用乙酸乙酯提取,后续是不用SPE进行净化。

Ø   GB/T22338-2008这个方法比较复杂,针对不同的动物组织采用了不同的提取剂,然后后续用到SPE的净化,比如说鸡肉和内脏的组织是用硅胶小柱净化,相对比较复杂一些。

Ø   GB 31658.2-2021是采用4%的氯化钠溶液和乙腈做提取剂。因为GB/T20756-2006是一个多残留方法,包括氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素,需要同时兼顾这三种药物残留的提取,碱性条件的提取,主要是为了让氟苯尼考、甲砜霉素有更加好的提取回收率。而GB 31658.2-2021是一个单残留的测定,只需考虑氯霉素残留的提取,所有无需碱性条件的提取。


关键词:动物组织中蛋白质、脂肪、杂质的去除

要点:

Ø   GB 31658.2是采用4%的氯化钠溶液对样品中的蛋白质进行沉淀,同时也加入了乙腈进一步沉淀样品组织中的蛋白质。然后,用正己烷进行萃取,去除动物组织中脂肪和杂质。接下来乙酸乙酯反萃取。


关键词:氮气吹干

要点:

Ø   提取后,注意氮气要吹干,如果没有吹干,样品中含有乙酸乙酯对后面的进行小柱净化有影响。


关键词:加水饱和乙酸乙酯溶液反萃取

要点:

Ø   由于洗脱液是用甲醇和水(114 mL,体积比较大,含水也比较高,不易挥发和浓缩。

Ø   加水饱和乙酸乙酯溶液进行反萃,实际上是进行了一个溶剂转换,

Ø   转换的目的,一方面是乙酸乙酯溶液比较容易吹干,另一方面也增加了一次萃取和净化,使得样品更加干净,进一步去除杂质。


8.2 净化 取固相萃取柱,依次用甲醇、水各10 mL预洗。备用液过柱,加水洗柱2次,每次3 mL, 加流动相4 mL,以1 mL/min速度洗脱,收集洗脱液。加水饱和乙酸乙酯溶液4 mL,涡旋振 荡1 min,2000 r/min离心5分钟,取上层液,重复处理1次,合并上层溶液,氮气吹干。加流动相1.0 mL使溶解,滤过,供液相色谱-串联质谱测定。


关键词:预洗

要点:

Ø   在净化过程中,C18小柱需要依次用甲醇、水各10 mL预洗,标准中净化柱使用的是传统的C18小柱 200 mg/6 mL (PNAN60B004),是一个很早就商品化的小柱,净化之前,C18小柱需要提前预洗,不能直接对干的小柱进行活化,不然会影响到回收率。

Ø   这个与后续商品化的HLB-P小柱不同,HLB-P小柱省去传统的活化、平衡步骤,样品经提取后直接过柱。


关键词:多步骤的萃取和反萃取

要点:

Ø   氯霉素提取和净化过程中经过了多步骤的萃取和反萃取,

Ø   具体步骤:乙腈+4 %氯化钠溶液提取→正己烷脱脂→加水饱和乙酸乙酯反萃→水-乙腈(95:5)复溶解→流动相洗脱→水饱和乙酸乙酯→流动相溶解→上机。

Ø   GB 31658.2这是一个很经典的提取体系,这么多次的萃取,实际上是利用了氯霉素在不同的溶剂体系中溶解度差异,从而来完成样液的净化和溶剂转换。整个过程包括了,萃取、反萃取、固相萃取柱净化,是一个很典型的样品净化和富集案例。

Ø   经过以上复杂的前处理操作流程,操作手法不太熟练,以及某些关键点没有注意到,很容易导致回收率受到影响。



GB 31658.2-2021前处理关键点和要点

动物性食品中氯霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法



原理

试料中残留的氯霉素,采用间位氯霉素或氘代氯霉素作内标,依次用乙腈、4%氯化钠去蛋白,正己烷脱脂,乙酸乙酯提取,固相萃取柱净化,氮气吹干,液相色谱-串联质谱法测定,内标法定量。



8.1提取 取试料5 g(准确至±0.02 g),加内标工作液250 µL、乙腈5 mL、 4 %氯化钠溶液5 mL,涡旋振荡2 min,4 000 r/min离心10 min,取上清液,残渣重复提取1 次,合并上清液。加正己烷5 mL,涡旋振荡1 min,2 000 r/min离心10 min,弃去上层液,正己烷重复处理1次。加水饱和的乙酸乙酯溶液5 mL,涡旋振荡1 min,2 000 r/min离心10 min,上层液转移到15 mL离心管中,重复提取1次,合并提取液,氮气吹干,加水-乙腈(95:5)3 mL使溶解,备用。


关键词:动物组织中蛋白质、脂肪、杂质的去除

要点:

  • GB 31658.2是采用4%的氯化钠溶液对样品中的蛋白质进行沉淀,同时也加入了乙腈进一步沉淀样品组织中的蛋白质。然后,用正己烷进行萃取,去除动物组织中脂肪和杂质。接下来乙酸乙酯反萃取。

关键词:氮气吹干

要点:

  • 提取后,注意氮气要吹干,如果没有吹干,样品中含有乙酸乙酯对后面的进行小柱净化有影响,从而影响回收率。

关键词:加水饱和乙酸乙酯溶液反萃取

要点:

  • 由于洗脱液是用甲醇和水(114 mL,体积比较大,含水也比较高,不易挥发和浓缩。

  • 加水饱和乙酸乙酯溶液进行反萃,实际上是进行了一个溶剂转换。

  • 转换的目的,一方面是乙酸乙酯溶液比较容易吹干,另一方面也增加了一次萃取和净化,使得样品更加干净,进一步去除杂质。



8.2净化 取固相萃取柱,依次用甲醇、水各10 mL预洗。备用液过柱,加水洗柱2次,每次3 mL, 加流动相4 mL,以1 mL/min速度洗脱,收集洗脱液。加水饱和乙酸乙酯溶液4 mL,涡旋振 荡1 min,2000 r/min离心5分钟,取上层液,重复处理1次,合并上层溶液,氮气吹干。加流动相1.0 mL使溶解,滤过,供液相色谱-串联质谱测定。



关键词:预洗

要点:

  • 在净化过程中,C18小柱需要依次用甲醇、水各10 mL预洗,标准中净化柱使用的是传统的C18小柱 200 mg/6 mL (PNAN60B004,纳鸥科技),是一个很早就商品化的小柱,净化之前,C18小柱需要提前预洗,不能直接对干的小柱进行活化,不然会影响到回收率。

  • 这个与后续商品化的HLB-P小柱不同,HLB-P小柱省去传统的活化、平衡步骤,样品经提取后直接过柱。

关键词:多步骤的萃取和反萃取

要点:

  • 氯霉素提取和净化过程中经过了多步骤的萃取和反萃取。

  • 具体步骤:乙腈+4 %氯化钠溶液提取→正己烷脱脂→加水饱和乙酸乙酯反萃→水-乙腈(95:5)复溶解→流动相洗脱→水饱和乙酸乙酯→流动相溶解→上机。

  • GB 31658.2这是一个很经典的提取体系,这么多次的萃取,实际上是利用了氯霉素在不同的溶剂体系中溶解度差异,从而来完成样液的净化和溶剂转换。整个过程包括了,萃取、反萃取、固相萃取柱净化,是一个很典型的样品净化和富集案例。

  • 经过以上复杂的前处理操作流程,操作手法不太熟练,以及某些关键点没有注意到,很容易导致回收率受到影响。




GB 31656.11-2021

水产品中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量的测定


第一法高效液相色谱(替代GB/T 22961-2008



原理

试样中土霉素、四环素、金霉素和多西环素的残留经柠檬酸缓冲溶液提取,固相萃取柱净化,液相色谱荧光检测器测定,外标法定量。


8.1 提取 取试料5 g(准确至±0.02 g),加柠檬酸缓冲液20 mL,涡旋震荡2min,超声10 min6000 r/min离心10 min,取上清液,残渣加柠檬酸缓冲液10 mL,重复提取两次,合并三次上清液,待净化。


关键词:GB 31656.11-2021GB/T 22961-2008在提取过程中的区别

要点:

  • GB/T 22961-2008相比,GB 31656.11-2021的提取次数为3次,同时去掉了正己烷脱脂的步骤。


8.2 净化 固相萃取柱依次用甲醇10 mL、水10 mL、柠檬酸缓冲液5 mL活化,取备用液过柱,用甲醇溶液10 mL、水10 mL淋洗,抽干,加甲醇10 mL,洗脱,收集洗脱液,40℃氮气吹干, 残渣加磷酸二氢钾溶液1.0 mL使溶解,超声1min,0.22 μm水相滤膜滤过,供高效液相色谱测定。


关键词:GB 31656.11-2021GB/T 22961-2008在净化过程中的区别

要点:

  • 在净化步骤方面,GB 31656.11-2021SPE净化的步骤更简单了,GB/T 22961-2008是需要用两种不同类型的SPE柱,先后进行净化,新的标准去掉了阳离子交换净化步骤。只保留了HLB的净化。

  • 另外,在HLB的洗脱液也有差异,在GB/T 22961是用乙酸乙酯做洗脱液,新国标的洗脱液直接用甲醇。




第二法液相色谱-串联质谱法


原理

试样中土霉素、四环素、金霉素和多西环素的残留用Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取,醋酸铅沉淀,正己烷除脂,固相萃取柱净化,液相色谱-串联质谱测定,外标法定量。


18.1提取 取试料2 g(准确至±0.02 g),加Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液6 mL、醋酸铅溶液2 mL, 涡旋混合1 min,超声10 min4℃以8000 r/min离心5 min,取上清液。残渣分别用Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液5 mL,重复提取两次,合并3次提取液。


关键词:醋酸铅

要点:

  • 提取过程增加了醋酸铅沉淀,正己烷脱脂。醋酸铅是一种常用的蛋白沉淀试剂,可以更有效去除动物组织提取液中的蛋白。同样,与方法一一样,提取3次。


18.2净化 向上述提取液加正己烷10 mL,涡旋1 min8000 r/min离心5min,取下层溶液,加Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液至20.0 mL,备用(鳗鲡、蟹和海参样品,需按照上述方法净化两次)取固相萃取柱依次用甲醇、水各5 mL活化,取备用液10.0 mL过柱,控制流速约1 mL/min, 用水、甲醇溶液各5 mL淋洗萃取柱,弃去流出液,减压抽干5 min。加甲醇-乙酸乙酯5 mL洗脱,收集洗脱液,40 ℃氮气吹至近干,加甲酸溶液(0.1%-乙腈1.0 mL溶解残渣,涡旋混匀, 滤过,为防药物变性,需及时供液相色谱-质谱仪测定。


关键词:过柱速度慢

要点:

  • GB 31656.11四环素类测定,加入醋酸铅后,仍然会出现过柱困难。主要是样品提取过程中把蛋白等杂质去除不太干净,需要充分地离心;建议离心时间稍微长一点,低温高速多次离心,快速过滤。


关键词:GB 31656.11-2021方法二和方法一净化过程的区别

要点:

  • 方法二选择的HLB小柱是小规格60mg/3 mL (PNAN60A002,纳鸥科技),方法一是500mg规格。

  • 另外,方法二在上柱之前加入了正己烷脱脂,由于使用的是小规格的小柱,需要尽可能去除干扰物,还有,方法二洗脱液是甲醇-乙酸乙酯,混合溶液来做洗脱液。最后,甲酸-乙腈复溶解,实现溶剂转换。














纳鸥科技
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