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下篇来啦!为什么别人做的回收率总比我高?新颁布36项兽残标准!

发表时间:2022-06-30 13:10

2022年5月19日,纳鸥科技公众号发布了文章为什么别人做的36项兽残回收率总比我高?(上篇)》:对GB 31656.8-2021、GB 31658.17、GB 31656.13三个常用标准的样品前处理关键点和要点等进行了总结,收到了广大检测工作者的积极反响。


现将后续3个标准:GB 31658.5(氟苯尼考及氟苯尼考胺残留量)、GB 31658.2(氯霉素残留量)、GB 31656.11(土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量)的前处理关键点和要点整理出来,供各位老师参考。




GB 31658.5-2021前处理关键点和要点

动物性食品中氟苯尼考及氟苯尼考胺残留量的测定


原理

试料中残留的氟苯尼考与氟苯尼考胺,用碱化的乙酸乙酯提取,正己烷除脂,固相萃取柱净化,液相色谱-串联质谱法测定,内标法定量。


8.1 提取 称取试料2g(准确到±0.02g),于50 mL离心管中,加氘代氯霉素内标溶液100 μL,涡动混匀,静置15 min。加乙酸乙酯-氨水溶液10 mL,涡动1 min,3000 r/min离心5 min,取上清液于100 mL鸡心瓶中,残渣重复提取两次,合并3次提取液。鸡心瓶中加5%乙酸2 mL,振摇混匀,于40 ℃水浴中浓缩至1.5 mL。转至另50 mL离心管中,用5% 乙酸2 mL洗涤鸡心瓶,洗涤液转至同一离心管,加正己烷5 mL脱脂,涡动1 min,3000 r/min离心5 min弃上层,下层提取液重复脱脂一次,备用。


关键词:碱性条件下提取,提取3

要点:

  • 氟苯尼考及氟苯尼考胺,在碱性条件下,更加容易被有机溶剂提取,可以获得满意的提取回收率。

  • 碱化的乙酸乙酯提取3次,浓缩后正己烷除脂。

关键词:5%乙酸

要点:

  • 在蒸发前,在鸡心瓶中加5%乙酸。有助于保护氟苯尼考胺在操作过程(合并、浓缩)中的回收率。


8.2 净化 MCX 固相萃取柱依次用甲醇2 mL和水2 mL活化。备用液过柱,用5 %乙酸2 mL淋洗, 用10 %氨甲醇5 mL洗脱。收集洗脱液,于40 ℃氮气吹干。用30 %乙腈水溶液500 μL溶解残余物,滤膜过滤,供超高效液相色谱-串联质谱测定。


关键词:GB 31658.5-2021GB/T 22959净化步骤区别

要点:

  • GB/T 22959之前的氟苯尼考检测标准,净化采取的是液液萃取法。

  • 对于样品基质比较复杂的情况,干扰物质较多,单纯的液液萃取和脱脂净化,不够理想的时候,使用SPE小柱将有更好净化效果,因此新标准GB 31658.5采取了MCX固相萃取净化。

关键词: 5 mL氨甲醇洗脱,氮吹

要点:

      Tips色谱柱或保护柱前加溶剂效应消除器(PN:AN80C037,谱宁科技),对于氟苯尼考和氟苯尼考胺检测限和定量限比较高的药物,5 mL氨甲醇洗脱后,可不经过氮吹,过滤膜后直接进行分析,不但可以满足检测要求,而且可以提高效率和目标物回收率,同时可以避免出现溶剂效应问题。(标准中氮吹的过程,一方面是为了浓缩样品,另一方面是为了转换溶剂,减少分析中出现的溶剂效应问题)。


注:溶剂效应消除器相关文章

发明专利:LC、LC/MS必备!改善峰形、提高柱效和分离度神器!

关键词:MCX固相萃取柱的特点和使用注意事项

要点:

  • 标准中使用的MCX 60 mg/3 mL (PN:AN60A012,纳鸥科技),混合型强阳离子交换反相柱,提供了双重保留模式:强阳离子交换+反相。

  • MCX小柱对于碱性化合物具有高的选择性,能够选择性保留阳离子化合物或者碱性化合物。

  • 当目标化合物酸化后,呈现出阳离子特征,通过电荷和分子间力的结合,从而保留在MCX小柱上,随后可以通过改变离子强度、PH值破坏分子间作用力,把目标分析物洗脱下来。

  • 所以前面提到的备用液是5%的乙酸,就是为了净化步骤上柱创造一个酸性条件。

  • 氟苯尼考和氟苯尼考胺在酸性环境下表现为阳离子,上柱后就能保留在MCX小柱上。随后是用5%的乙酸淋洗,去除干扰物的同时,需要的分析物仍旧保留在小柱上。

  • 洗脱时,洗脱液是10 %氨甲醇,这时目标分析物就不在表现为阳离子,从而洗脱下来,实现了净化效果。




GB 31658.2-2021前处理关键点和要点

动物性食品中氯霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法


原理

试料中残留的氯霉素,采用间位氯霉素或氘代氯霉素作内标,依次用乙腈、4%氯化钠去蛋白,正己烷脱脂,乙酸乙酯提取,固相萃取柱净化,氮气吹干,液相色谱-串联质谱法测定,内标法定量。


8.1提取 取试料5 g(准确至±0.02 g),加内标工作液250 µL、乙腈5 mL、 4 %氯化钠溶液5 mL,涡旋振荡2 min,4 000 r/min离心10 min,取上清液,残渣重复提取1 次,合并上清液。加正己烷5 mL,涡旋振荡1 min,2 000 r/min离心10 min,弃去上层液,正己烷重复处理1次。加水饱和的乙酸乙酯溶液5 mL,涡旋振荡1 min,2 000 r/min离心10 min,上层液转移到15 mL离心管中,重复提取1次,合并提取液,氮气吹干,加水-乙腈(95:5)3 mL使溶解,备用。


关键词:动物组织中蛋白质、脂肪、杂质的去除

要点:

  • GB 31658.2是采用4%的氯化钠溶液对样品中的蛋白质进行沉淀,同时也加入了乙腈进一步沉淀样品组织中的蛋白质。然后,用正己烷进行萃取,去除动物组织中脂肪和杂质。接下来乙酸乙酯反萃取。

关键词:氮气吹干

要点:

  • 提取后,注意氮气要吹干,如果没有吹干,样品中含有乙酸乙酯对后面的进行小柱净化有影响,从而影响回收率。

关键词:加水饱和乙酸乙酯溶液反萃取

要点:

  • 由于洗脱液是用甲醇和水(114 mL,体积比较大,含水也比较高,不易挥发和浓缩。

  • 加水饱和乙酸乙酯溶液进行反萃,实际上是进行了一个溶剂转换。

  • 转换的目的,一方面是乙酸乙酯溶液比较容易吹干,另一方面也增加了一次萃取和净化,使得样品更加干净,进一步去除杂质。


8.2净化 取固相萃取柱,依次用甲醇、水各10 mL预洗。备用液过柱,加水洗柱2次,每次3 mL, 加流动相4 mL,以1 mL/min速度洗脱,收集洗脱液。加水饱和乙酸乙酯溶液4 mL,涡旋振 荡1 min,2000 r/min离心5分钟,取上层液,重复处理1次,合并上层溶液,氮气吹干。加流动相1.0 mL使溶解,滤过,供液相色谱-串联质谱测定。

关键词:预洗

要点:

  • 在净化过程中,C18小柱需要依次用甲醇、水各10 mL预洗,标准中净化柱使用的是传统的C18小柱 200 mg/6 mL (PNAN60B004,纳鸥科技),是一个很早就商品化的小柱,净化之前,C18小柱需要提前预洗,不能直接对干的小柱进行活化,不然会影响到回收率。

  • 这个与后续商品化的HLB-P小柱不同,HLB-P小柱省去传统的活化、平衡步骤,样品经提取后直接过柱。

关键词:多步骤的萃取和反萃取

要点:

  • 氯霉素提取和净化过程中经过了多步骤的萃取和反萃取。

  • 具体步骤:乙腈+4 %氯化钠溶液提取→正己烷脱脂→加水饱和乙酸乙酯反萃→水-乙腈(95:5)复溶解→流动相洗脱→水饱和乙酸乙酯→流动相溶解→上机。

  • GB 31658.2这是一个很经典的提取体系,这么多次的萃取,实际上是利用了氯霉素在不同的溶剂体系中溶解度差异,从而来完成样液的净化和溶剂转换。整个过程包括了,萃取、反萃取、固相萃取柱净化,是一个很典型的样品净化和富集案例。

  • 经过以上复杂的前处理操作流程,操作手法不太熟练,以及某些关键点没有注意到,很容易导致回收率受到影响。



GB 31656.11-2021

水产品中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量的测定


第一法高效液相色谱(替代GB/T 22961-2008


原理

试样中土霉素、四环素、金霉素和多西环素的残留经柠檬酸缓冲溶液提取,固相萃取柱净化,液相色谱荧光检测器测定,外标法定量。


8.1 提取 取试料5 g(准确至±0.02 g),加柠檬酸缓冲液20 mL,涡旋震荡2min,超声10 min6000 r/min离心10 min,取上清液,残渣加柠檬酸缓冲液10 mL,重复提取两次,合并三次上清液,待净化。


关键词:GB 31656.11-2021GB/T 22961-2008在提取过程中的区别

要点:

  • GB/T 22961-2008相比,GB 31656.11-2021的提取次数为3次,同时去掉了正己烷脱脂的步骤。


8.2 净化 固相萃取柱依次用甲醇10 mL、水10 mL、柠檬酸缓冲液5 mL活化,取备用液过柱,用甲醇溶液10 mL、水10 mL淋洗,抽干,加甲醇10 mL,洗脱,收集洗脱液,40℃氮气吹干, 残渣加磷酸二氢钾溶液1.0 mL使溶解,超声1min,0.22 μm水相滤膜滤过,供高效液相色谱测定。


关键词:GB 31656.11-2021GB/T 22961-2008在净化过程中的区别

要点:

  • 在净化步骤方面,GB 31656.11-2021SPE净化的步骤更简单了,GB/T 22961-2008是需要用两种不同类型的SPE柱,先后进行净化,新的标准去掉了阳离子交换净化步骤。只保留了HLB的净化。

  • 另外,在HLB的洗脱液也有差异,在GB/T 22961是用乙酸乙酯做洗脱液,新国标的洗脱液直接用甲醇。



第二法液相色谱-串联质谱法


原理

试样中土霉素、四环素、金霉素和多西环素的残留用Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取,醋酸铅沉淀,正己烷除脂,固相萃取柱净化,液相色谱-串联质谱测定,外标法定量。


18.1提取 取试料2 g(准确至±0.02 g),加Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液6 mL、醋酸铅溶液2 mL, 涡旋混合1 min,超声10 min4℃以8000 r/min离心5 min,取上清液。残渣分别用Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液5 mL,重复提取两次,合并3次提取液。


关键词:醋酸铅

要点:

  • 提取过程增加了醋酸铅沉淀,正己烷脱脂。醋酸铅是一种常用的蛋白沉淀试剂,可以更有效去除动物组织提取液中的蛋白。同样,与方法一一样,提取3次。


18.2净化 向上述提取液加正己烷10 mL,涡旋1 min8000 r/min离心5min,取下层溶液,加Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液至20.0 mL,备用(鳗鲡、蟹和海参样品,需按照上述方法净化两次)取固相萃取柱依次用甲醇、水各5 mL活化,取备用液10.0 mL过柱,控制流速约1 mL/min, 用水、甲醇溶液各5 mL淋洗萃取柱,弃去流出液,减压抽干5 min。加甲醇-乙酸乙酯5 mL洗脱,收集洗脱液,40 ℃氮气吹至近干,加甲酸溶液(0.1%-乙腈1.0 mL溶解残渣,涡旋混匀, 滤过,为防药物变性,需及时供液相色谱-质谱仪测定。


关键词:过柱速度慢

要点:

  • GB 31656.11四环素类测定,加入醋酸铅后,仍然会出现过柱困难。主要是样品提取过程中把蛋白等杂质去除不太干净,需要充分地离心;建议离心时间稍微长一点,低温高速多次离心,快速过滤。


关键词:GB 31656.11-2021方法二和方法一净化过程的区别

要点:

  • 方法二选择的HLB小柱是小规格60mg/3 mL (PNAN60A002,纳鸥科技),方法一是500mg规格。

  • 另外,方法二在上柱之前加入了正己烷脱脂,由于使用的是小规格的小柱,需要尽可能去除干扰物,还有,方法二洗脱液是甲醇-乙酸乙酯,混合溶液来做洗脱液。最后,甲酸-乙腈复溶解,实现溶剂转换。














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