下篇来啦！为什么别人做的回收率总比我高？新颁布36项兽残标准！

2022年5月19日，纳鸥科技公众号发布了文章《为什么别人做的36项兽残回收率总比我高？（上篇）》：对GB 31656.8-2021、GB 31658.17、GB 31656.13三个常用标准的样品前处理关键点和要点等进行了总结，收到了广大检测工作者的积极反响。

现将后续3个标准：GB 31658.5（氟苯尼考及氟苯尼考胺残留量）、GB 31658.2（氯霉素残留量）、GB 31656.11（土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量）的前处理关键点和要点整理出来，供各位老师参考。

GB 31658.5-2021前处理关键点和要点

动物性食品中氟苯尼考及氟苯尼考胺残留量的测定

原理

试料中残留的氟苯尼考与氟苯尼考胺，用碱化的乙酸乙酯提取，正己烷除脂，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。

8.1 提取 称取试料2g（准确到±0.02g），于50 mL离心管中，加氘代氯霉素内标溶液100 μL，涡动混匀，静置15 min。加乙酸乙酯-氨水溶液10 mL，涡动1 min，3000 r/min离心5 min，取上清液于100 mL鸡心瓶中，残渣重复提取两次，合并3次提取液。鸡心瓶中加5%乙酸2 mL，振摇混匀，于40 ℃水浴中浓缩至1.5 mL。转至另50 mL离心管中，用5% 乙酸2 mL洗涤鸡心瓶，洗涤液转至同一离心管，加正己烷5 mL脱脂，涡动1 min，3000 r/min离心5 min弃上层，下层提取液重复脱脂一次，备用。

关键词：碱性条件下提取，提取3次

要点：

• 氟苯尼考及氟苯尼考胺，在碱性条件下，更加容易被有机溶剂提取，可以获得满意的提取回收率。

• 碱化的乙酸乙酯提取3次，浓缩后正己烷除脂。

关键词：5%乙酸

要点：

• 在蒸发前，在鸡心瓶中加5%乙酸。有助于保护氟苯尼考胺在操作过程（合并、浓缩）中的回收率。

8.2 净化 MCX 固相萃取柱依次用甲醇2 mL和水2 mL活化。备用液过柱，用5 %乙酸2 mL淋洗， 用10 %氨甲醇5 mL洗脱。收集洗脱液，于40 ℃氮气吹干。用30 %乙腈水溶液500 μL溶解残余物，滤膜过滤，供超高效液相色谱-串联质谱测定。

关键词：GB 31658.5-2021与GB/T 22959净化步骤区别

要点：

• GB/T 22959之前的氟苯尼考检测标准，净化采取的是液液萃取法。

• 对于样品基质比较复杂的情况，干扰物质较多，单纯的液液萃取和脱脂净化，不够理想的时候，使用SPE小柱将有更好净化效果，因此新标准GB 31658.5采取了MCX固相萃取净化。

关键词: 5 mL氨甲醇洗脱，氮吹

要点：

      Tips：色谱柱或保护柱前加溶剂效应消除器（PN：AN80C037，谱宁科技），对于氟苯尼考和氟苯尼考胺检测限和定量限比较高的药物，5 mL氨甲醇洗脱后，可不经过氮吹，过滤膜后直接进行分析，不但可以满足检测要求，而且可以提高效率和目标物回收率，同时可以避免出现溶剂效应问题。（标准中氮吹的过程，一方面是为了浓缩样品，另一方面是为了转换溶剂，减少分析中出现的溶剂效应问题）。

注：溶剂效应消除器相关文章

发明专利：LC、LC/MS必备！改善峰形、提高柱效和分离度神器！（专利号：201510005647.8 ）

关键词：MCX固相萃取柱的特点和使用注意事项

要点：

• 标准中使用的MCX 60 mg/3 mL (PN:AN60A012，纳鸥科技），混合型强阳离子交换反相柱，提供了双重保留模式：强阳离子交换+反相。

• MCX小柱对于碱性化合物具有高的选择性，能够选择性保留阳离子化合物或者碱性化合物。

• 当目标化合物酸化后，呈现出阳离子特征，通过电荷和分子间力的结合，从而保留在MCX小柱上，随后可以通过改变离子强度、PH值破坏分子间作用力，把目标分析物洗脱下来。

• 所以前面提到的备用液是5%的乙酸，就是为了净化步骤上柱创造一个酸性条件。

• 氟苯尼考和氟苯尼考胺在酸性环境下表现为阳离子，上柱后就能保留在MCX小柱上。随后是用5%的乙酸淋洗，去除干扰物的同时，需要的分析物仍旧保留在小柱上。

• 洗脱时，洗脱液是10 %氨甲醇，这时目标分析物就不在表现为阳离子，从而洗脱下来，实现了净化效果。

GB 31658.2-2021前处理关键点和要点

动物性食品中氯霉素残留量的测定 液相色谱－串联质谱法

原理

试料中残留的氯霉素，采用间位氯霉素或氘代氯霉素作内标，依次用乙腈、4%氯化钠去蛋白，正己烷脱脂，乙酸乙酯提取，固相萃取柱净化，氮气吹干，液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。

8.1提取 取试料5 g（准确至±0.02 g），加内标工作液250 µL、乙腈5 mL、 4 %氯化钠溶液5 mL，涡旋振荡2 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液，残渣重复提取1 次，合并上清液。加正己烷5 mL，涡旋振荡1 min，2 000 r/min离心10 min，弃去上层液，正己烷重复处理1次。加水饱和的乙酸乙酯溶液5 mL，涡旋振荡1 min，2 000 r/min离心10 min，上层液转移到15 mL离心管中，重复提取1次，合并提取液，氮气吹干，加水-乙腈（95:5）3 mL使溶解，备用。

关键词：动物组织中蛋白质、脂肪、杂质的去除

要点：

• GB 31658.2是采用4%的氯化钠溶液对样品中的蛋白质进行沉淀，同时也加入了乙腈进一步沉淀样品组织中的蛋白质。然后，用正己烷进行萃取，去除动物组织中脂肪和杂质。接下来乙酸乙酯反萃取。

关键词：氮气吹干

要点：

• 提取后，注意氮气要吹干，如果没有吹干，样品中含有乙酸乙酯对后面的进行小柱净化有影响，从而影响回收率。

关键词：加水饱和乙酸乙酯溶液反萃取

要点：

• 由于洗脱液是用甲醇和水（1：1）4 mL，体积比较大，含水也比较高，不易挥发和浓缩。

• 加水饱和乙酸乙酯溶液进行反萃，实际上是进行了一个溶剂转换。

• 转换的目的，一方面是乙酸乙酯溶液比较容易吹干，另一方面也增加了一次萃取和净化，使得样品更加干净，进一步去除杂质。

关键词：预洗

要点：

• 在净化过程中，C18小柱需要依次用甲醇、水各10 mL预洗，标准中净化柱使用的是传统的C18小柱 200 mg/6 mL (PN：AN60B004，纳鸥科技），是一个很早就商品化的小柱，净化之前，C18小柱需要提前预洗，不能直接对干的小柱进行活化，不然会影响到回收率。

• 这个与后续商品化的HLB-P小柱不同，HLB-P小柱省去传统的活化、平衡步骤，样品经提取后直接过柱。

关键词：多步骤的萃取和反萃取

要点：

• 氯霉素提取和净化过程中经过了多步骤的萃取和反萃取。

• 具体步骤：乙腈+4 %氯化钠溶液提取→正己烷脱脂→加水饱和乙酸乙酯反萃→水-乙腈（95:5）复溶解→流动相洗脱→水饱和乙酸乙酯→流动相溶解→上机。

• 在GB 31658.2这是一个很经典的提取体系，这么多次的萃取，实际上是利用了氯霉素在不同的溶剂体系中溶解度差异，从而来完成样液的净化和溶剂转换。整个过程包括了，萃取、反萃取、固相萃取柱净化，是一个很典型的样品净化和富集案例。

• 经过以上复杂的前处理操作流程，操作手法不太熟练，以及某些关键点没有注意到，很容易导致回收率受到影响。