实战宝典 新颁布36项兽残标准前处理关键点和要点（上篇）

   由农业农村部、国家卫生健康委员会、国家市场监督管理总局联合发布的36项兽药残留检测标准，于2022年2月1日正式实施，其中32项标准为全新发布。

整个分析过程中，样品前处理所需要的时间约占全部分析时间的 60%-70%，前处理过程引入的误差约占整个误差的 30%-40%，因此样品前处理方法的选取和使用，直接关系到整个分析方法的成败和优劣。

因此，针对其中新颁布国标中6个经常使用的标准：GB 31656.8-2021（有机磷类药物残留量)、GB 31658.17（四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量）、GB 31656.13（硝基呋喃类代谢物多残留）、GB31658.2（氯霉素残留量）、GB 31658.5（氟苯尼考及氟苯尼考胺残留量）、GB 31656.11（土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量），这些标准的前处理从样品提取、净化等步骤结合标准文本，对相应的关键点和要点等进行了总结。

GB31656.8-2021水产品中有机磷类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

原理：

试样中有机磷类药物的残留经酸化乙腈提取，经PSA 吸附剂净化（QuEChERS方法），液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。

8.1 提取取试样5 g（准确至±0.02g），加混合内标工作液100 μL（4.4.5）、1%乙酸乙腈25.0 mL、无水乙酸钠1 g（4.1.2），漩涡混合2min，超声30 min，8 000 r/min离心10min；取上清液，备用。

关键词：酸化乙腈提取

要点：

Ø   有一些有机磷农药在碱性条件下特别容易降解，所以在提取过程中加入一定的酸，比较有代表性的敌百虫，特别容易在碱性条件下转化为敌敌畏，在检测中会发现敌敌畏的峰高了很多，出现敌百虫回收率下降，敌敌畏回收率增高现象。

4.5 材料PSA（N-丙基乙二胺）吸附剂：颗粒直径为 40～60 μm

关键词： 40～60 μm

要点：

在选择PSA吸附剂材料的颗粒直径是40～60 μm，因为直径在细一点或在粗一点，会导致在前处理过程中的吸附效果和净化效果有差别。

6.1 试料的制备取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。

关键词：粉碎均匀

要点：

在粉碎过程中一定要把样品粉碎均匀，粉碎不均匀容易导致在提取过程中，相应的农药提取不出来，导致结果偏差。

8.2净化备用液加PSA吸附剂500mg，漩涡振荡1 min，8 000 r/min离心10min；取上清液5.0 mL， 45℃下氮气吹干，准确量取定容液1.0 mL（4.2.1）溶解残渣，加PSA吸附剂200 mg，旋涡1 min， 5 000 r/min离心10min，取上清液过膜后，供液相色谱-串联质谱测定。实验过程需要注意避光操作，样品前处理完成后应及时上机检测。

关键词：温度

要点：

Ø   标准中净化是在45℃下氮气吹干，有机磷农药在高温的情况下特别容易分解，导致回收率下降。所以为了避免有机磷农药受到温度降解，可以把温度调低一点，可以在30℃氮吹。

Ø   TIPS：在色谱柱前增加一个溶剂效应消除器（PN：AN80C037），可省去净化后氮吹，直接乙腈提取后进样分析，不但解决了溶剂效应问题，而且峰形更对称。更大的优势是一方面可节省2-3个小时的氮吹过程（乙腈作为提取剂，挥发性较差，氮吹时间非常长），提高检测效率和降低检测成本，另一方面避免了氮吹浓缩过程中有机磷农药的降解和挥发，提高了回收率。

关键词：滤膜

要点：

Ø   第二步净化，上清液过膜时，经过第一步PSA净化后，现在上清液是70%的水相，过膜前需要考察一下滤膜的吸附性，因为水相高时容易导致膜吸附目标物，从而影响回收率。

Ø   再生纤维素滤膜，可以较好解决高水相滤膜吸附目标物的问题。（Anavo-U Syringe Filter, RC, 0.22μm, 13 mm，PN：AN40A025）

关键词：高脂肪样品

要点：

Ø   对于高脂肪含量的水产品（鳗鱼），在使用乙腈进行萃取时，一方面，一些脂类化合物会被同时萃取出来对下一步的分析带来困难；另一方面，一些脂溶性的非极性化合物会保留在样品基质中而降低萃取效率。因此，对于高脂肪含量的样品需要进行冷冻离心处理。

GB31658.17-2021动物性食品中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量的测定

原理

试样中残留的四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物，用Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液提取，亲水亲脂平衡型固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。

6.1 试料的制备取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。

关键词：发热、回收率

要点：

8.1 提取 称取试料1 g （精确至±0.01 g），加Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液8 mL，涡旋1 min，超声20 min，-2°C 10 000 r/min离心5 min，收集上清液。残渣中加磷酸盐缓冲液8 mL，重复提取一次，合并两次提取液，混匀，备用。

关键词：提取次数2次

要点：

Ø   标准品中用了2次提取，两次提取用的提取液是不一样的。

第1次采用Mcllvaine-Na2EDTA，此缓冲液是提取四环素类兽残的常用试剂，

但有几个在磺胺类药物单纯用Mcllvaine-Na2EDTA提取回收率不理想，第2次提取用了Mcllvaine-Na2EDTA+磷酸盐缓冲液，对于磺胺类药物有较好的回收率。

关键词：低温

要点：

5.5 材料 亲水亲脂平衡型固相萃取柱：200 mg/6 mL，或相当者

关键词：亲水亲脂平衡型固相萃取柱

要点：

Ø   国标中净化材料的是亲水亲脂平衡型固相萃取柱，也就是我们平时用的HLB小柱 200 mg/6 mL（纳鸥科技，PN:AN60A005），HLB小柱表面同时具有亲水性和疏水性基团，对各类极性、非极性化合物具有较均衡的吸附作用。

其吸附能力和样品容量是 C18 键合硅胶的 3~10 倍，许多在 C18 难以得到保留的强亲水性化合物，在HLB 上仍有较好的回收率。

8.2 净化   固相萃取柱依次用甲醇 5 mL 和水 5 mL 活化，取备用液过柱，依次用水 5 mL 和20%甲醇水溶液 5 mL 淋洗，抽干，用洗脱液 10 mL 洗脱。收集洗脱液，45℃水浴氮气吹干。 加入复溶液 1.0 mL，涡旋 1 min 溶解残余物，14000 r/min 离心 5 min，微孔滤膜过滤，液相色谱-串联质谱测定。

关键点：氮吹

要点：

Ø   建议控制氮吹时间、温度和流速。实验过程氮吹时间非常长，约60分钟，容易造成部分化合物回收率偏低（比如：四环素类、青霉素类）。

Ø   建议氮吹至100 μL 左右，不氮吹干，可以减少在氮吹过程中部分目标化合物的损失。

关键词：溶剂效应

要点：

Ø   复溶时，加入 0.1%甲酸溶液定容至 1 mL,可以有效的改善部分目标化合物的峰型，降低溶剂效应，同时提高部分化合物的回收率。

Ø   此外，在色谱柱前加一个小配件（溶剂效应消除器，PN：AN80C037），可较好解决由于样品溶剂和流动相不匹配而造成的溶剂效应问题，使峰形更好，响应更高。

GB 31656.13-2021

水产品中硝基呋喃类代谢物多残留的测定液相色谱－串联质谱法

原理

试料中残留的硝基呋喃类蛋白结合态代谢物在酸性条件下水解，经2-硝基苯甲醛衍生化，用乙酸乙酯液液萃取，高速离心净化，液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。

7.1 水解与衍生化 取试料2 g（精确至±0.01 g），于50 mL聚丙烯离心管中，准确加入混合内标标准工作液50 μL，涡旋混合1 min，加盐酸溶液5 mL、2-硝基苯甲醛溶液0.15 mL，涡旋混合1 min，37ºC 避光振荡16 h。

关键词：洗涤样品

要点：

Ø   GB/T 21311-2007之前的标准的样品在水解之前先用10 mL甲醇水洗涤样品，新标准在水解前是不洗涤样品的。

Ø   这一点需要注意，因为硝基呋喃类药物的代谢物在动物体内多数是以蛋白结合的形式存在，但有部分是游离态的，比如说SEM、AOZ。

Ø   目前没有明确的实验结论证明，硝基呋喃类药物的代谢物只是以蛋白结合状态存在，所以洗涤样品的时候会将游离态的残留物洗掉，从而影响结果的准确性。

8.2 提取净化 取出离心管冷却至室温，用磷酸氢二钾溶液调pH值至7.0～7.5，加乙酸乙酯8 mL，涡旋振荡1 min，6000 r/min离心5 min，取上清液至10 mL玻璃离心管，40 ºC氮气吹干。加5%甲醇溶液1.0 mL溶解残留物，再将溶液转移至1.5 mL离心管中，以14000 r/min的转速离心10 min，取下层清液过0.22 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱分析。