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固相萃取基础知识

发表时间:2020-07-18 11:40

     

       固相萃取(Solid-Phase Extraction,简称 SPE)是近年发展起来一种样品预处理技术,由固液萃取和液相色谱技术相结合发展而来,主要用于样品的分离、纯化和浓缩,与传统的液液萃取法相比,可以提高分析物的回收率,更有效的将分析物与干扰组分分离,简化样品预处理过程,操作简单、省时、省力,广泛的应用于医药、食品、环境、商检、化妆品、化工等领域。



固相萃取原理和保留机理

       固相萃取是一个包括液相和固相的物理萃取过程。在固相萃取中,固相对分离物的吸附力比溶解分离物的溶剂更大。当样品溶液通过吸附剂床时,分离物浓缩在其表面,其他样品成分通过吸附剂床;通过只吸附分离物而不吸附其他样品成分的吸附剂,可以得到高纯度和浓缩的分离物。在固相萃取中,最常用的方法是将固体吸附剂装在一个针筒状柱子里,使样品溶液通过吸附剂床,样品中的化合物或通过吸附剂,或保留在吸附剂上(依靠吸附剂对溶剂的相对吸附)。“保留”是一种存在于吸附剂和分离物分子间吸引的现象,造成当样品溶液通过吸附剂床时,分离物在吸附剂上不移动。保留是三个因素的作用:分离物、溶剂和吸附剂。所以,一个给定的分离物的保留行为在不同溶剂和吸附剂存在下是变化的。“洗脱”是一种保留在吸附剂上的分离物从吸附剂上去除的过程,这通过加入一种对分离物的吸引比吸附剂更强的溶剂来完成。


      针对填料保留机理的不同(填料保留目标化合物或保留杂质),操作稍有不同。


1、保留目标化合物模式

① 活化 ---- 除去小柱内的杂质并创造一定的溶剂环境。

② 上样 ---- 将样品用一定的溶剂溶解,转移入柱并使组分保留在柱上。

③ 淋洗 ---- 最大程度除去干扰物。

④ 洗脱 ---- 用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。


2、保留杂质模式

① 活化 ---- 除去柱子内的杂质并创造一定的溶剂环境。

② 上样 ---- 将样品转移入柱,此时大部分目标化合物会随样品基液流出,杂质被保留在柱上,故此步骤要开始收集。

③ 洗脱 ---- 用小体积的溶剂将组分淋洗下来并收集,合并收集液。

此种情况多用于食品或农残分析中去除色素。


固相萃取相互作用类型


1. 正相固相萃取:

     所用的吸附剂都是极性的,取决于目标化合物的极性官能团与吸附剂表面的极性官能团之间相互作用,其中包括了氢键,π—π 键相互作用,偶极-偶极相互作用和偶极-诱导偶极相互作用以及其他的极性-极性作用。


2. 反相固相萃取:

      所用的吸附剂和目标化合物通常是非极性的或极性较弱的,主要是靠非极性-非极性相互作用,是范德华力或色散力。


3. 离子交换固相萃取:

       是靠目标化合物与吸附剂之间的相互作用的静电吸引力。


4. 混合型作用:

      离子交换和反相保留混合模式,既适用于吸附带有电荷的化合物(离子交换作用),又适用于分离疏水或极性物质(反相作用机理)。


固相萃取主要过程


1. 选择 SPE 小柱或滤膜

      首先应根据待测物的理化性质和样品基质 , 选择对待测物有较强保留能力的固定相。若待测物带负电荷 , 可用阴离子交换填料 , 反之则用阳离子交换填料。若为中性待测物 , 可用反相填料萃取。SPE 小柱或滤膜的大小与规格应视样品中待测物的浓度大小而定。对于浓度较低的体内样品 , 一般应选用尽量少的固定相填料萃取较大体积的样品。


2. 活化

      萃取前先用充满小柱的溶剂冲洗小柱或用 5 ~ 10 mL 溶剂冲洗滤膜。一般可先用甲醇等水溶性有机溶剂冲洗填料 , 因为甲醇能润湿吸附剂表面 , 并渗透到非极性的硅胶键合相中 , 使硅胶更容易被水润湿 , 之后再加入水或缓冲液冲洗。加样前 , 应使 SPE 填料保持湿润 , 如果填料干燥会降低样品保留值 ; 而各小柱的干燥程度不一 , 则会影响回收率的重现性。


3. 上样

      一般可采取以下措施 : (1) 用 0.1 mol/L 酸或碱调节 , 使pH<3 或 pH>9, 离心取上层液萃取;(2) 用甲醇、乙腈等沉淀蛋白质后取上清液 , 以水或缓冲液稀释后萃取;(3) 用酸或无机盐沉淀蛋白质后取上清液 , 调节 pH 值后萃取;(4) 超声 15 min 后加入水、缓冲液 , 取上清液萃取。尿液样品中的药物浓度较高 , 加样前先用水或缓冲液稀释 , 必要时可用酸、碱水解反应破坏药物与蛋白质的结合 , 然后萃取。流速应控制为 1 mL/min, 流速快不利于待测物与固定相结合。


4. 淋洗

      反相 SPE 的清洗溶剂多为水或缓冲液 , 可在清洗液中加入少量有机溶剂、无机盐或调节 pH 值。加入小柱的清洗液应不超过一个小柱的容积 , 而 SPE 滤膜为 5 ~10 mL。


5. 洗脱待测物

      应选用 5 ~10 mL 离子强度较弱但能洗下待测物的洗脱溶剂。若需较高灵敏度 , 则可先将洗脱液挥干后 , 再用流动相重组残留物后进样。体内样品洗脱后多含有水 , 可选用冷冻干燥法。保留能力较弱的 SPE 填料可用小体积、较弱的洗脱液洗下待测物 , 再用极性较强的 HPLC 分析柱,如 C18柱分析洗脱物。若待测物可电离 , 可调节 pH 值 , 抑制样品离子化 , 以增强待测物在反相 SPE 填料中的保留 , 洗脱时调节 pH 值使其离子化,并用较弱的溶剂洗脱 , 收集洗脱液后再调节 pH 值使其在 HPLC 分析中达到最佳分离效果。在洗脱过程中应减慢流速 , 用两次小体积洗脱代替一次大体积洗脱 , 回收率更高。





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